枸杞霉腐病拮抗酵母分離鑒定、生長曲線繪制與抑菌機理初探
1.3 方法
1.3.1 酵母lut-Y1菌株的分離純化及鑒定
酵母lut-Y1菌株分離自發生霉腐的寧夏枸杞鮮果。選取具有典型霉腐斑的果實，在病健交界處剪取約5 mm x 5 mm的小塊組織。先用2%的次氯酸鈉溶液對組織塊表面消毒5分鐘，用無菌水清洗5遍，再用75%的酒精消毒30秒，最后用無菌水清洗8遍。將消毒后的組織塊轉移至無菌培養皿中，加入1 mL無菌水并搗碎。隨后，用接種環蘸取含菌組織液，在PDA固體培養基平板上進行劃線分離。將平板置于28℃培養箱中培養，待菌落長出后，根據形態特征挑取疑似酵母的單菌落。此純化過程連續進行3次，以確保獲得純培養物。純化后的菌株即為酵母lut-Y1，保存于PDA斜面培養基上，置于4℃冰箱備用。
酵母lut-Y1菌株菌落形態觀察方法: 將酵母lut-Y1菌株劃線培養至PDA固體培養基，30 ℃倒置培養2 d后觀察菌落形態。挑取PDA固體培養基上的菌體粘在碳導膠樣品臺上，置于液氮中速凍后在掃描電鏡下觀察細胞形態。
酵母lut-Y1菌株分子鑒定方法: 將酵母lut-Y1菌株接種到PDA固體培養基上，30 ℃條件下培養2 d后送至寶生物工程(大連)有限公司進行菌株基因組DNA提取、聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和內轉錄間隔區(ITS)區序列測序，將所得序列與GenBank核酸數據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進行比對，用MEGA7.0軟件和Neighbor joining法進行系統發育分析和進化樹構建，自展次數為1000。最終根據ITS區序列測序分析及形態學鑒定，鑒定該菌株，并將該菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC NO.20462。
1.3.2 酵母lut-Y1菌株的生長特性
1.3.2.1 生長曲線的繪制
將活化后的lut-Y1斜面菌株用無菌水制成菌懸液。取一定體積的菌懸液，以1%（體積分數）的接種量接種到含有50 mL PDA液體培養基的無菌培養瓶中。將接種后的培養瓶置于丹麥Biosense公司oCelloScope微生物生長曲線分析系統中，設定溫度為30℃，進行連續培養40 h。系統會自動、實時監測并記錄菌懸液在特定光學參數下的變化（如透光率或細胞密度相關信號），以此反映菌體生長情況。系統軟件將根據監測數據自動繪制生長曲線。
1.3.2.2 最適溫度的測定
將500 μL菌懸液接種于50 mL PDA液體培養基，分別在25、30、35 ℃溫度條件下，160 r/min振蕩培養24 h，用紫外可見分光光度計在波長600 nm處測定培養液的吸光度，吸光度越大，則菌體密度越大。
1.3.2.3 最適pH值的測定
分別用1 mol/L NaOH溶液或1 mol/L HCl溶液調整PDA液體培養基的pH值，使其pH值分別為4、5、6、7、8、9。在不同pH值的50 mL PDA液體培養基中分別接種500 μL酵母lut-Y1菌株的菌懸液。將接種好的培養基分別置于30 ℃、160 r/min振蕩培養24 h。在600 nm處測量吸光度，吸光度越大，則菌體密度越大。
1.3.2.4 耐鹽性的測定
將500 μL酵母lut-Y1菌株的菌懸液分別接種到50 mL不同NaCl濃度(0%、0.5%、1.0%、3.0%、5.0%)的PDA液體培養基中，于30 ℃、160 r/min振蕩培養24 h，在600 nm處測量吸光度，吸光度越大，則菌體密度越大，以不添加NaCl的PDA液體培養基為對照。
1.3.3 酵母lut-Y1菌株的拮抗作用測定
采用平板對峙法將酵母lut-Y1菌株與待試病原菌[鏈格孢菌(Alternaria alternate)、小孢殼二孢(Ascochyta leptospora)、細極鏈格孢菌(Alternaria tenuissima)]劃線接種在同一PDA固體培養基平板上，觀察菌落生長狀況。
1.3.4 酵母lut-Y1菌株發酵液抑菌效果的測定
發酵液的制備: 按1%(體積分數)的接種量將500 μL酵母lut-Y1菌株菌懸液接種到50 mL PDA液體培養基中，在30 ℃、160 r/min條件下振蕩培養18 h后，將發酵液4000 r/min離心10 min，上清液即為酵母lut-Y1菌株發酵液。
待試病原菌菌餅的制作: 分別向待試病原菌(鏈格孢菌、小孢殼二孢、細極鏈格孢菌)斜面菌種中加入4 mL無菌水，充分振蕩，制成菌懸液后，取1 mL涂布在PDA固體培養基平板中，在室溫下培養5~7 d，至菌體長滿平板，用無菌打孔器在平板中央取直徑為1 cm的待試病原菌菌餅。
酵母lut-Y1菌株發酵液對待試病原菌抑制效果的測定: 按表1配制梯度濃度發酵液-PDA固體培養基，滅菌后分裝在直徑9 cm的培養皿中，每皿25 mL。在發酵液-PDA固體培養基平板中央放置待試病原菌菌餅，置于30 ℃的恒溫培養箱分別培養5~7 d，觀察菌落形態，并測量待試病原菌的生長圈直徑。用SPSS 26.0統計軟件進行單因素方差分析待試菌的生長圈直徑變化。
表1 酵母lut-Y1菌株發酵液-PDA固體培養基的配制
| 組別 | 發酵液體積/mL | PDA固體培養基/mL |
|---|---|---|
| 處理組 10% | 10 | 90 |
| 處理組 20% | 20 | 80 |
| 處理組 30% | 30 | 70 |
| 處理組 40% | 40 | 60 |
| 對照組 | 0 | 100 |
1.4 數據處理與統計分析
試驗均設5次重復，采用SPSS 26.0軟件分析數據，結果以平均值±標準差表示。單因素方差分析比較多組間均數，組間兩兩比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。
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