水膠體食品微生物計(jì)數(shù)的智能化解決方案——材料與方法
2. 材料和方法
2.1. 樣品采集和制備
從工業(yè)制造商處收到卡拉膠粉末樣品（n=6），在分析前以室溫（20-22°C）儲(chǔ)存在無菌密封袋中的標(biāo)記塑料容器中。選擇六個(gè)樣品（A、B、C、D、E和F）代表按顏色和溶解度區(qū)分的不同類型卡拉膠，以涵蓋一系列具有挑戰(zhàn)性的吸濕性食品樣品。卡拉膠粉末樣品包括低和高微生物濃度的樣品（根據(jù)制造商自己的QC和標(biāo)準(zhǔn)），包括一個(gè)QC拒收樣品（樣品A），其微生物污染超過其可接受限度5000 CFU/g。樣品A（10% w/w）用于接種污染較少的樣品（BS、CS、DS、ES和FS），以在不同類型的卡拉膠中分析不同的微生物負(fù)載。此外，通過將拒收樣品A與另一批<100 CFU/g的卡拉膠樣品A混合，將樣品A稀釋以獲得三種微生物濃度（稀釋倍數(shù)為5×、10×和50×）。總共分析了14個(gè)樣品，以下稱為原始樣品、稀釋（/稀釋倍數(shù)）或接種（S）：（A、A/5、A/10、A/50、B、BS、C、CS、D、DS、E、ES、F、FS）。
2.2. 傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)
將5克卡拉膠粉末與495毫升Butterfield磷酸鹽緩沖稀釋水（BPDW）一起加入無菌均質(zhì)袋中。BPDW由499.375毫升蒸餾水和0.625毫升BPDW儲(chǔ)備溶液（34克KH2PO4，500毫升蒸餾水，用1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH 7.2）組成。將卡拉膠和BPDW的混合物在均質(zhì)器中以速度設(shè)置3均質(zhì)2分鐘。為了計(jì)數(shù)總需氧平板計(jì)數(shù)，將2.5毫升稀釋樣品的等分試樣分配到四個(gè)空培養(yǎng)皿（90×15毫米）中，總分析體積為10毫升，用約15毫升溫?zé)岬模?6°C）平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）覆蓋，并用無菌L形塑料涂布器快速混合。這對(duì)應(yīng)于最終卡拉膠樣品稀釋倍數(shù)約為600×（495毫升BPDW中的5克，并在瓊脂中進(jìn)一步稀釋6×）和PCA平板中最終卡拉膠樣品濃度為8.3毫克/毫升。一旦凝固和干燥，平板在35°C下培養(yǎng)72小時(shí)。手動(dòng)計(jì)數(shù)菌落數(shù)量，結(jié)果表示為log CFU/g。所有卡拉膠樣品（n=14）在兩天內(nèi)進(jìn)行兩次獨(dú)立分析重復(fù)測(cè)試。一個(gè)瓊脂平板定義為一個(gè)重復(fù)，每個(gè)樣品產(chǎn)生四個(gè)技術(shù)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)的檢測(cè)限為40 CFU/g。
2.3. 卡拉膠中蔓延細(xì)菌的MALDI-TOF MS鑒定
從傳統(tǒng)瓊脂平板中選擇卡拉膠樣品中細(xì)菌污染物的蔓延菌落以獲得鑒定。通過亞培養(yǎng)在PCA平板（35°C下24-48小時(shí)）上獲得所選細(xì)菌的純培養(yǎng)物。按照乙醇/甲酸/乙腈方案對(duì)PCA平板上的新鮮菌落進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。所有分離株通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）進(jìn)行三次分析，結(jié)果由Biotyper算法和數(shù)據(jù)庫在屬水平上報(bào)告。
2.4. 迷你瓊脂平板的制備
使用放置在無菌6孔板中的無菌IntuGrow迷你瓊脂平板（直徑=25毫米）來計(jì)數(shù)微菌落。將350微升溫?zé)岬腜CA瓊脂（48°C）加入每個(gè)迷你瓊脂平板中，然后在每個(gè)平板上沉積20毫克卡拉膠粉末。為了抑制卡拉膠的水膠體吸濕能力，在頂部添加800微升溫?zé)岬腜CA瓊脂，以最小程度地稀釋并將卡拉膠粉末封裝在兩層瓊脂之間。這對(duì)應(yīng)于最終卡拉膠稀釋倍數(shù)57.5×（1.15毫升PCA中的0.02克卡拉膠）和最終迷你瓊脂平板中卡拉膠濃度為17.4毫克/毫升。一個(gè)迷你瓊脂平板定義為一個(gè)重復(fù)，檢測(cè)限為50 CFU/g。
2.5. 通過光學(xué)延時(shí)顯微鏡檢測(cè)微生物
將3D光學(xué)顯微鏡掃描系統(tǒng)oCelloScope放置在培養(yǎng)箱（35°C）中，將準(zhǔn)備好的迷你瓊脂平板的6孔板加載到系統(tǒng)中，使用IntuGrow軟件進(jìn)行延時(shí)圖像生長分析。微菌落的檢測(cè)按照先前報(bào)道的研究進(jìn)行，并進(jìn)行了一些修改。簡(jiǎn)而言之，每小時(shí)為每個(gè)孔生成5670張圖像，持續(xù)20小時(shí)。應(yīng)用的技術(shù)設(shè)置是照明時(shí)間為2毫秒，視野（FOV）為1.4毫米×1.05毫米，聚焦深度為10微米，光學(xué)分辨率為1.35微米，光學(xué)放大倍數(shù)為4.0。成像從下方進(jìn)行，與由于各種卡拉膠類型的吸濕能力而在瓊脂頂部觀察到的不規(guī)則和變化的瓊脂高度相比，迷你瓊脂平板內(nèi)獲得了更平坦和光滑的瓊脂側(cè)面。相對(duì)于水平面傾斜（6.25°）的光學(xué)軸能夠掃描迷你瓊脂平板并形成圖像堆棧。通過組合傾斜圖像生成單個(gè)z平面的投影z堆棧圖像。
2.6. 使用算法增強(qiáng)水膠體樣品中微菌落的可視化
為了補(bǔ)償在培養(yǎng)最初幾小時(shí)內(nèi)由于卡拉膠粉末的吸濕性質(zhì)而在瓊脂基質(zhì)中發(fā)生的變化，在IntuGrow軟件（版本0.1.14.216）中開發(fā)了自適應(yīng)DELAY算法，用于監(jiān)測(cè)微菌落的生長。DELAY功能因此是對(duì)樣品進(jìn)行有意的延遲重新調(diào)整照明和聚焦。它應(yīng)用于為經(jīng)歷緩慢幾何變化（如膨脹）的樣品生成更好聚焦的圖像。在這項(xiàng)工作中，延遲時(shí)間大致由膨脹瓊脂達(dá)到其靜止形狀的時(shí)間常數(shù)等效設(shè)置。延遲圖像應(yīng)用于歸一化使用在延遲時(shí)間點(diǎn)確定的相同照明和聚焦設(shè)置記錄的后續(xù)延時(shí)圖像。因此，在正常化圖像中延遲時(shí)間點(diǎn)之后出現(xiàn)的變化抑制了膨脹瓊脂的影響，同時(shí)增強(qiáng)了對(duì)生長微菌落存在的檢測(cè)。
圖1. 延遲算法中用于圖像歸一化的成像與掃描步驟流程圖，該算法旨在降低瓊脂中卡拉膠溶脹效應(yīng)，并增強(qiáng)最終處理圖像中生長微菌落的檢測(cè)能力。Tdelay表示溶脹過程穩(wěn)定所需的時(shí)間；ReAuto-illumination（自動(dòng)重照明）與ReAuto-focus（自動(dòng)重對(duì)焦）可在該時(shí)間點(diǎn)啟動(dòng)新一輪掃描，并每小時(shí)采集一次圖像。
2.7. 統(tǒng)計(jì)分析
所有微生物計(jì)數(shù)基于在不同日期進(jìn)行的兩次生物學(xué)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)為四次重復(fù)（總計(jì)n=8），IntuGrow為兩次重復(fù)（總計(jì)n=4）。所有重復(fù)的CFU/g結(jié)果使用GraphPad Prism 10在疊加散點(diǎn)圖中可視化。對(duì)于平板上零菌落的樣品，使用0.5 CFU的虛擬值來可視化CFU低于傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)和IntuGrow檢測(cè)限（分別為40和50 CFU/g）的重復(fù)次數(shù)。對(duì)于統(tǒng)計(jì)分析，零計(jì)數(shù)值包括在兩種方法每個(gè)14個(gè)樣品的所有CFU計(jì)數(shù)平均值的計(jì)算中。然后對(duì)CFU/g的平均值（n=14）進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，并用于回歸分析，其中使用Deming回歸比較兩種方法在不同卡拉膠類型和微生物濃度之間的計(jì)數(shù)。插入完美相關(guān)線（x=y）作為視覺參考。為了評(píng)估和可視化兩種方法之間的差異，使用平均值（n=14）計(jì)算偏差，制作Bland-Altman圖。圖表和統(tǒng)計(jì)計(jì)算使用GraphPad Prism 10進(jìn)行。
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